Inibidores de PCR

A Reação em cadeira da polimerase (PCR) é uma ferramenta sensível e de extrema importância. Utilizada na amplificação de DNA para diversas aplicações desde a pesquisa científica ao diagnóstico molecular, esta técnica pode ser facilmente afetada pela presença de inibidores. Esses inibidores impedem o funcionamento correto da reação de PCR através de mecanismos como a ligação ao DNA, impedindo com que a DNA polimerase incorpore novos nucleotídeos durante a reação, ou ligação na própria enzima polimerase, inativando-a ou reduzindo sua eficiência, gerando resultados negativos ou inconclusivos. 

Os inibidores de PCR podem ser decorrentes de diversas fontes, incluindo a própria amostra como, por exemplo, a hemoglobina presente no sangue, o colágeno dos tecidos, a ureia da urina, etc. Outra fonte possível de inibidores são os reagentes utilizados no processo de extração e purificação do DNA proveniente das amostras, tais como SDS, fenol, etanol, isopropanol, entre outros.  

A detecção de inibidores de PCR pode ser realizada por meio do uso de controles positivos e negativos que permitem monitorar a eficiência da amplificação e analisar a presença de inibidores.  

Existem formas de mitigar os efeitos dos inibidores de PCR e aumentar a sensibilidade da técnica, sendo algumas delas: 

• A adição de agentes quelantes de metais ou detergentes iônicos, como EDTA (Etilenodiaminotetracético), à reação de PCR contribui para neutralizar a presença de íons metálicos ou lipídios Inibidores. 
• O uso de Tween 20, um detergente não iônico, é utilizado como facilitador de amplificação, por reduzir a inibição da PCR principalmente em amostra de fezes, polissacarídeos vegetais e compostos fenólicos.
• A utilização de DMSO (Dimetilsulfóxido) como facilitador de amplificação, em concentrações entre 2-10%, promove desnaturação de regiões com pareamentos CG, reduzindo a temperatura de melting, porém quando utilizado em concentração acima de 10% dificulta a atividade da enzima DNA polimerase.
• A purificação e a extração adequadas do DNA podem remover algumas impurezas e inibidores presentes na amostra. O uso de kits comerciais para esta etapa permite maior controle de qualidade das soluções utilizadas, garantindo resultados estáveis.
• A escolha da DNA polimerase correta, com maior resistência a inibidores conhecidos, também é fundamental para obter resultados confiáveis.
• Evitar o uso de luvas sem talco também é uma maneira de impedir a adição de inibidores de PCR durante o manuseio, tendo em vista que o talco atua como um inibidor.
• Utilização de materiais livres de DNAase, RNAse e pirogênios. Os materiais podem ser adquiridos de origem livre de inibidores ou serem tratados in loco, como, como o DEPC (Dietil Pirocarbonato), capaz de inibir permanentemente a RNAse.